养犬滑膜细胞原代细胞大半年，踩了不少坑，总结一套顺手方案，分享给需要的小伙伴。
一、分离：酶消化法比组织块法稳定
取材：无菌取犬膝关节或髋关节滑膜。关键要把附着的脂肪和筋膜剔除干净——只取那层淡粉、光滑的薄层。脂肪太多会飘着不贴壁，筋膜混进去会长成纤维细胞。我会在PBS里加两性霉素B（0.25 μg/mL）洗三遍，防真菌污染。
消化：剪成1 mm³糊状，加0.2% Ⅱ型胶原酶+0.1%透明质酸酶（无血清DMEM配）。犬滑膜胶原多，单用胶原酶太慢。37℃摇床120 rpm消化2-4小时。观察到组织块变絮状、液体浑浊就差不多了。千万别超过6小时，否则细胞活率掉得厉害。终止用含10% FBS的培养基，100 μm筛网过滤，300 g离心5分钟，沉淀就是细胞。
二、培养：低代次是王道
培养基：高糖DMEM+15%特级FBS+1%双抗。原代前24小时我习惯双抗加倍到2%。
接种：T25瓶，48小时后首次半换液——这一步能洗掉不贴壁的血细胞和碎片。之后每3天全换液。
传代：大约7-10天长到80-90%融合。0.25%胰酶-EDTA消化，1-2分钟细胞变圆立即终止。强烈建议用P2-P4代做实验，P0-P1长得太慢，P6以后细胞变宽、老化，标志物表达也变了。
冻存：50% FBS+40%培养基+10% DMSO。复苏时加10 μM Y-27632，贴壁率明显提高。 三、鉴定：至少做两项 形态：贴壁后从圆形变梭形，长开后呈长梭形或多角形，漩涡状排列。但和成纤维细胞太像，不能单看形态。
三、免疫荧光鉴定：
阳性用Vimentin、CD44；如果想区分A型（巨噬细胞样）和B型（成纤维样），就加测CD68——A型阳性。 流式：P2代细胞CD44/CD90阳性率>95%，CD45阴性（排除血源细胞），这是最硬的标准。
四、避坑小记
污染：犬滑膜取材最容易长真菌，PBS里加两性霉素B洗组织，比事后加药管用。
老化：细胞长满后最多再放一天，不及时传代就会变圆、脱落、长黑点——救不回来。 传代纯度：若混有成纤维细胞（形态太难区分），用有限稀释法挑克隆，或者认倒霉重新提一次。 消化时机：宁可稍微不足再补消化，也不要一次消化过度。活力差的细胞后续实验数据飘得厉害。
作为国内原代细胞领域技术领跑者，云克隆深耕细分领域技术壁垒，不仅实现常规原代细胞的规模化供应，更攻克多项高难度、稀缺性原代细胞制备技术。现有六大物种滑膜原代细胞全系上市，搭配此前推出的多物种关节软骨细胞，形成“软骨+滑膜”双核心、多物种全覆盖的骨关节研究完整产品线。
武汉云克隆有近二十年的原代细胞研发经验，依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠，兔，犬，猫，山羊，豚鼠等560多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务。
扫一扫
被折叠的 条评论
为什么被折叠?
到【灌水乐园】发言
