易基因：Redox Biol/IF11.9：RNA-BS揭示氧化应激下NSUN5介导的m5C甲基化驱动肺腺癌化疗耐药新机制

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近日，哈尔滨医科大学肿瘤医院蔡莉教授和邢影教授团队合作，在国际权威期刊《Redox Biology》上发表题为“Oxidative stress-driven m5C methylation by NSUN5 confers cisplatin resistance in lung adenocarcinoma through promoting glycolysis”的科研成果，探索了肺腺癌（LUAD）对顺铂（CDDP）产生获得性耐药的新机制，揭示NSUN5作为氧化应激响应的关键RNA m5C甲基转移酶，是氧化应激条件下顺铂耐药的关键驱动因子。        

研究发现，顺铂化疗诱导的活性氧（ROS）不仅通过Nrf2转录激活上调NSUN5表达，还通过增强其Cys359位点的RNA捕获能力来提升其甲基转移酶活性。NSUN5上调通过其关键催化残基Cys359和Cys308，催化GLUT1 mRNA发生m5C修饰，该修饰被m5C reader蛋白YBX1识别并结合，从而稳定GLUT1转录本，上调其表达。进而促进糖酵解（Warburg效应）和同源性重组（HR）修复，最终介导LUAD细胞顺铂耐药性。敲低NSUN5或GLUT1均可有效逆转这一耐药表型。研究整合RNA亚硫酸盐测序（RNA-BS）与RNA-seq技术，从表观转录组系统解析了“氧化应激-NSUN5-GLUT1-糖酵解-HR修复”的耐药信号轴，为克服LUAD顺铂耐药提供了新的治疗靶点。

英文标题：Oxidative stress-driven m5C methylation by NSUN5 confers cisplatin resistance in lung adenocarcinoma through promoting glycolysis

译文标题：氧化应激条件下NSUN5介导的m5C甲基化通过促进糖酵解促进肺腺癌顺铂耐药

发表时间：2026年4月26日

发表期刊：Redox Biology

影响因子：IF11.9/Q1

技术平台：RNA-BS（RNA-Bis-seq）、RNA-seq

作者单位：哈尔滨医科大学附属肿瘤医院

研究摘要

铂类药物化疗是晚期肺腺癌（LUAD）的一线标准治疗方案，但顺铂耐药通常引起癌症复发和转移。本研究确定了NSUN5是氧化应激条件下顺铂耐药的关键驱动因子，NSUN5过表达在临床上与LUAD的顺铂耐药和不良预后相关。研究通过整合RNA-BS和RNA-seq分析鉴定出GLUT1是其关键靶点。NSUN5通过两个功能位点催化GLUT1 mRNA的m5C甲基化：Cys359负责RNA结合，Cys308负责释放m5C修饰的RNA。随后，YBX1识别并稳定这种m5C修饰的转录本。最终NSUN5以GLUT1依赖性方式增强葡萄糖摄取，导致糖酵解增加，从而促进同源重组修复。功能研究证实，敲低NSUN5通过增加DNA损伤使LUAD细胞对顺铂增敏。至关重要的是，沉默GLUT1在体外和体内均可部分逆转NSUN5介导的顺铂耐药。总之，NSUN5通过调控Warburg效应将氧化应激信号转化为增强的同源重组修复，提示其在克服LUAD获得性化疗耐药方面的治疗潜力。

研究亮点

（1）在顺铂耐药的肺腺癌中，RNA m5C水平显著升高。

（2）顺铂诱导的氧化应激激活Nrf2，从转录水平上调NSUN5表达。

（3）活性氧通过增强Cys359的RNA捕获能力，提升NSUN5的甲基转移酶活性。

（4）NSUN5/GLUT1轴通过促进肺腺癌细胞糖酵解，从而促进顺铂耐药性。

图形摘要：ROS/NSUN5/YBX1/m5C-GLUT1轴在驱动顺铂耐药中的作用模型

研究方法

（1）样本

临床样本：顺铂敏感/耐药LUAD患者肿瘤组织。

细胞模型：利用人LUAD细胞系（A549、PC9）建立顺铂耐药亚株（A549/DDP、PC9/DDP），并构建NSUN5敲低/过表达以及点突变（Cys359A、Cys308A）细胞模型。

（2）表型与功能实验

细胞活力/凋亡/DNA损伤、ROS水平、RNA稳定性、代谢分析、DNA修复分析。

（3）分子机制探索

RNA-BS：A549/DDP细胞在NSUN5敲低前后（shNC vs. shNSUN5）寻找其直接催化的m5C修饰位点，结合RNA-seq数据，精准锁定了GLUT1 mRNA。

RNA-seq：NSUN5敲低后鉴定受NSUN5调控的差异表达基因（DEGs）。RNA-seq与RNA-BS

联合分析鉴定NSUN5的m5C修饰靶标及下游调控基因。

（4）下游验证实验

m5C-MeRIP-qPCR：验证特定mRNA（如GLUT1）的m5C修饰水平。

RIP-qPCR：使用NSUN5或YBX1抗体进行RNA免疫沉淀，检测其与GLUT1 mRNA的结合。

RNA pull-down：使用生物素标记的GLUT1 mRNA探针捕获结合蛋白，通过HPLC-MS/MS鉴定互作蛋白（如NSUN5、YBX1）。

ChIP：验证转录因子Nrf2与NSUN5启动子区的结合。

双荧光素酶报告基因实验：验证Nrf2对NSUN5启动子的转录激活作用，以及NSUN5/YBX1对GLUT1 m5C位点的功能影响。

结果图形

（1）RNA m5C修饰水平及NSUN5表达升高与LUAD顺铂耐药相关

研究首先建立顺铂耐药的临床相关性。研究团队通过免疫组化（IHC）分析发现，顺铂耐药LUAD患者肿瘤组织中m5C水平显著高于敏感患者（图1A）。同时，在实验室建立的两种顺铂耐药LUAD细胞系（A549/DDP和PC9/DDP）中，同样观察到其全局RNA m5C水平高于亲代细胞（图1B），提示RNA m5C修饰与顺铂耐药可能密切相关。为探究背后的调控因子，研究团队分析了17种已知的m5C调控因子在TCGA、GEO数据库中的表达，发现NSUN5是同时与肿瘤发生和顺铂处理相关的关键基因（图1C-F）。药物敏感性预测证实NSUN5在耐药的患者和细胞系中均表现为显著高表达，且其高表达与LUAD患者更差的总生存期显著相关（图1H-O）。上述结果表明NSUN5是与LUAD顺铂耐药相关的关键癌基因和潜在治疗靶点。

图1：顺铂耐药的肺腺癌表现出m5C修饰和NSUN5表达增加

（2）ROS诱导的NSUN5上调通过减轻DNA损伤促进顺铂耐药

研究发现，顺铂以剂量和时间依赖性方式上调NSUN5表达（图2A）。H2O2处理同样诱导NSUN5升高，而ROS清除剂Tempol有效抑制顺铂诱导的NSUN5上调及核积累（图2B-D），证实ROS是NSUN5诱导的关键信号。机制研究鉴定出Nrf2是介导ROS信号、转录激活NSUN5表达的转录因子，ChIP实验证实Nrf2可以直接与NSUN5启动子区域结合（图2G-H）。功能研究表明NSUN5敲低显著降低耐药细胞顺铂IC50（图2I），增加凋亡比例（图2J、L），促进DNA损伤（γH2AX升高、彗星实验尾矩增加）（图2K-L）。相反，NSUN5过表达增强耐药、减少凋亡、减轻DNA损伤。裸鼠移植瘤实验证实NSUN5过表达在顺铂治疗下显著促进肿瘤生长（图2N-O）。上述研究结果表明氧化应激通过Nrf2转录上调NSUN5，帮助肿瘤细胞抵抗顺铂诱导的DNA损伤和凋亡。

图2：氧化应激诱导的NSUN5上调通过减轻DNA损伤促进肺腺癌的顺铂耐药

（3）RNA亚硫酸盐测序（Bis-seq）和RNA测序（RNA-seq）鉴定GLUT1为NSUN5靶点

免疫荧光证实NSUN5在LUAD细胞中核富集（图2F）。为寻找NSUN5下游的功能靶标，研究者首先在NSUN5敲低的A549/DDP细胞中进行RNA-BS，发现NSUN5敲低介导整体m5C水平降低（图3A），且主要富集于蛋白编码转录本的编码序列（CDS）、3'UTR和内含子区（图3B）。NSUN5敲低显著降低各甲基化水平m5C位点数量（图3C）。

RNA-seq鉴定出7978个差异表达基因（DEGs），GO分析显示富集于DNA损伤修复和糖酵解通路（图3D-E）。整合RNA-BS和RNA-seq数据，鉴定出149个转录本存在重叠，其中64个表现为低甲基化伴随下调（hypo-down），代表NSUN5的直接靶标，其中糖代谢关键基因GLUT1以其最显著的“甲基化降低-表达下调”标靶（图3F-G）。TCGA-LUAD数据库中NSUN5与GLUT1 mRNA表达呈正相关（图3H），IHC显示低NSUN5患者GLUT1降低比例更高（图3I）。NSUN5敲低导致GLUT1在转录和翻译水平显著下调（图3J-K），降低GLUT1 mRNA m5C修饰并缩短其半衰期（图3L-M）。而NSUN5过表达则上调GLUT1、m5C修饰及mRNA稳定性（图3N-P）。上述分析结果成功鉴定出GLUT1是NSUN5介导m5C修饰并稳定其表达的直接靶基因。

图3：NSUN5调控其下游靶基因GLUT1的m5C修饰和表达

（4）GLUT1对NSUN5诱导的顺铂耐药至关重要

研究团队在NSUN5过表达的A549和PC9细胞中敲低GLUT1，发现之前由NSUN5高表达所赋予的顺铂耐药表型被显著逆转。具体表现为：顺铂IC50降低（图4A）、细胞凋亡增加（图4B）、DNA损伤加重（γH2AX和Cleaved Caspase 3升高）（图4C-E）。裸鼠移植瘤实验中，NSUN5过表达显著增加顺铂治疗下的肿瘤负荷，而GLUT1敲低逆转此耐药表型（图4F-H）。IHC显示NSUN5过表达降低γH2AX和Cleaved Caspase 3、升高HR修复标志物p-RPA2，GLUT1抑制则逆转这些效应（图4I）。这些结果表明NSUN5诱导的顺铂耐药依赖于GLUT1。

图4：NSUN5在体外和体内以GLUT1依赖性方式赋予顺铂耐药性

（5）顺铂诱导的活性氧（ROS）增强NSUN5甲基转移酶活性

为排除内源NSUN5干扰，使用CRISPR/Cas9构建NSUN5-KO细胞。顺铂增强NSUN5的RNA捕获能力，该效应被Tempol逆转（图5A-B）。研究团队基于NSUN5催化m5C修饰的三个步骤（图5C），靶向两个关键的半胱氨酸残基Cys359（负责RNA结合）和Cys308（负责释放甲基化RNA）进行了点突变研究，并构建了HA标签的NSUN5WT、C308A、C359A及双突变体（图5D）。结果显示，顺铂处理下，C359A突变体RNA结合能力受损，而C308A突变体RNA滞留增强（图5E）。突变体均无法有效提升GLUT1蛋白表达和mRNA稳定性（图5H-K），双荧光素酶实验显示NSUN5WT增加GLUT1-WT报告基因活性，对GLUT1-MUT无影响（图5L）。这表明ROS通过促进依赖于Cys359的RNA捕获，从而增强NSUN5的甲基转移酶活性。

图5：顺铂诱导的ROS增强NSUN5甲基转移酶活性，以促进GLUT1 mRNA的m5C修饰

结论和启示

本研究通过RNA-BS、RNA-seq和一系列功能实验揭示了NSUN5是氧化应激条件下LUAD顺铂耐药的关键驱动因子。顺铂诱导的ROS通过Nrf2激活上调NSUN5表达，同时增强其甲基转移酶活性；NSUN5催化GLUT1 mRNA的m5C修饰，被YBX1识别并稳定，促进糖酵解和HR修复，最终赋予耐药表型。靶向NSUN5/GLUT1轴可逆转耐药。

RNA-BS在本研究中的重要作用

全转录组m5C图谱绘制：首次在顺铂耐药LUAD细胞中建立NSUN5依赖的m5C修饰图谱，揭示m5C主要分布于CDS区，同时在3'UTR和内含子区有信号（图3B），为理解m5C在mRNA中的空间分布规律提供数据。

定量解析甲基化水平变化：通过比较shNC和shNSUN5细胞的RNA-BS数据，定量展示NSUN5敲低后各甲基化水平m5C位点数量的减少（图3C），直接证明NSUN5对整体m5C修饰的调控作用。

靶基因筛选与验证：整合Bis-seq与RNA-seq数据，从149个重叠基因中筛选出GLUT1作为NSUN5最可能的直接靶标（图3F-G）。

后续位点特异性验证：Bis-seq鉴定的m5C峰值位点为后续m5C-MeRIP、双荧光素酶报告基因（GLUT1-WT vs GLUT1-MUT）实验提供精确的序列信息，确保功能验证的准确性。

参考文献：Wang X, Ning J, Cao M, Liu W, Sun S, Dou M, Cai L, Xing Y. Oxidative stress-driven m5C methylation by NSUN5 confers cisplatin resistance in lung adenocarcinoma through promoting glycolysis. Redox Biol. 2026 Apr 27;94:104193. doi: 10.1016/j.redox.2026.104193.