一文搞懂可变多聚腺苷酸化APA及其检测技术

可变多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation，APA）是真核生物中非常常见的一类RNA加工调控方式。它和我们前面介绍过的可变剪接（写给科研新人：10分钟，彻底搞懂文献里的Isoform与可变剪接）一样，都会让同一个基因产生不同形式的转录本。只不过，可变剪接主要是在“中间怎么剪、怎么拼”上做文章，而APA更像是解答“这条mRNA，应该在哪里结束”。今天，我们来详细介绍下可变多聚腺苷酸化及其检测技术。

一 mRNA的尾巴

在真核生物中，基因被转录形成的是一条尚未完全成熟的RNA（pre-mRNA)。它需要经过一系列加工，才能成为成熟的mRNA。常见的加工步骤包括5'端加帽，剪接、去除内含子、连接外显子，3'端切割，加上一段poly(A)尾巴(多聚腺苷酸尾)。

所谓poly(A)尾巴，就是在mRNA的3'末端加上一串A碱基。这条尾巴会影响mRNA的稳定性、出核、定位、翻译效率和降解速度。

图：前体mRNA的转录及转录后加工[1]

二 可变多聚腺苷酸化APA

• 多聚腺苷酸化

在mRNA成熟过程中，细胞会先在RNA的3'端附近识别特定信号，然后进行切割，再添加poly(A)尾巴。这个过程就叫做多聚腺苷酸化（polyadenylation）。那么，细胞里的剪切机器是怎么在长长的RNA序列里，准确找到那个“该挨刀”的位置呢？这里就需要聊到另外一个概念“多聚腺苷酸化位点”。

• 多聚腺苷酸化位点

Polyadenylation site（多聚腺苷酸化位点，简称poly(A) site或PAS）是指真核生物mRNA前体在转录后加工过程中，被切割并加上poly(A)尾巴的位置。在哺乳动物中，一个典型的polyadenylation区域通常包括以下元件[2]。

（1）UGUA（上游元件），在PAS hexamer上游；

（2）PAS hexamer（PAS六聚体）：切割位点上游~10-30 nt，序列为AAUAAA或其变体（如 AUUAAA）；

（3）切割位点：hexamer下游约20 nt，常位于CA二核苷酸处；

（4）下游U-rich/GU-rich元件：切割位点下游（3’方向），

图：功能性PAS序列的上下文信息[2]

• 多聚腺苷酸化分子机制

polyadenylation/APA的机制可以概括为Pol II转录过程中，新生pre-mRNA上的UGUA、AAUAAA、cleavage site和下游U/GU-rich元件共同招募CPA复合体（cleavage and polyadenylation machinery）；CPSF、CFI、CSTF、CFII、PAP、PABPN1等因子完成识别、切割和加poly(A)尾。若转录本中存在多个PAS，这些位点会在RNA元件强度、CPA因子丰度/活性、Pol II延伸动力学、转录终止因子、剪接和RNA结合蛋白调控下竞争使用，从而产生APA isoforms[2]。

几个关键元件和因子对应关系

图：在RNA聚合酶II（Pol II）介导的转录过程中，切割与多聚腺苷酸化（CPA）机制会结合新生RNA中的PAS六聚体基序AAUAAA及其周围序列元件[2]。

• 可变多聚腺苷酸化APA

很多基因并不是只有一个poly(A)位点，而是可能有多个候选位点（PAS）。细胞在不同组织、不同发育阶段、不同刺激条件下，可能会选择不同的poly(A)位点来结束这条mRNA。这种现象就叫做——可变多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation，APA）。

说得更直白一点，同一个基因可以因为选择了不同的“结尾位置”，产生不同长度或不同结构的mRNA，即mRNA isoform。

三 APA会产生哪些类型的变化？

通常情况，有两类APA：3’UTR APA和内含子APA（Intronic APA，IPA)。

• 3′ UTR APA

3′UTR APA发生在终末外显子内部，这个更为普遍。同一个终末外显子中存在两个或多个PAS，分别是proximal PAS（近端）和distal PAS（远端）。如果选择proximal PAS，mRNA 会拥有较短的3'UTR；如果选择distal PAS（远端），mRNA会拥有较长的3'UTR。

3'UTR上常常分布着很多调控元件，比如miRNA结合位点、RNA结合蛋白结合位点、影响mRNA定位、稳定性和翻译效率的序列元件。因此，3'UTR变短或变长，可能会改变这条mRNA被谁调控、是否容易被降解、翻译效率高不高。

一个常见现象是某些细胞在增殖活跃或肿瘤状态下，会出现广泛的3' UTR缩短。短3'UTR可能逃避部分miRNA或RNA结合蛋白的抑制，从而让相关基因表达更活跃。当然，这不是绝对规律，具体还要看基因、细胞类型和调控背景。

图：APA产生多个mRNA isoform[2]

• 内含子APA（Intronic APA，IPA)

由内含子poly(A)位点生成的转录本被称为“内含子多聚腺苷酸化异构体”或“可变末端外显子异构体”。许多内含子多聚腺苷酸化异构体具有生理功能，它们通过改变蛋白质的C末端（羧基端），产生与全长蛋白功能不同、但同样具有生理活性和特定功能的新蛋白。这是细胞在不改变基因组的前提下，丰富蛋白质组多样性的重要手段。这类异构体常以细胞类型特异性方式表达。

异常的IPA会导致提前多聚腺苷酸化（Premature CPA），产生无法发挥正常功能的截短蛋白。在B细胞白血病中，基因突变率其实非常低。然而，癌细胞却能巧妙地通过激活IPA来产生截短的、无功能的蛋白质，从而让抑癌基因“失活”[2]。这相当于用RNA水平的加工异常，替代了DNA水平的基因突变，达到了同样致癌的效果。

四 APA和可变剪接有什么区别？

很多新人会把APA和可变剪接混在一起，因为它们都能让同一个基因产生多个转录本。可变剪接关注的是中间的片段怎么剪、怎么拼。APA关注的是这条转录本在哪里结束、尾巴加在哪里。

举个简单例子，一条pre-mRNA有外显子1、2、3、4。

可变剪接可能让它变成：

Exon 1 + Exon 2 + Exon 4；

Exon 1 + Exon 3 + Exon 4；

Exon 1 + Exon 2 + Exon 3 + Exon 4。

而APA可能让它变成：

Exon 1 + Exon 2 + Exon 3，然后提前结束；

Exon 1 + Exon 2 + Exon 3 + Exon 4，然后在更远的位置结束。

当然，实际情况中可变剪接和APA并不是完全割裂的。它们常常互相影响，共同决定一个基因最终会产生哪些成熟转录本。

五 为什么越来越重视APA？

因为APA虽然发生在mRNA的“结尾”，却能深刻影响基因表达调控。

01 APA影响mRNA稳定性

如果一个mRNA的3'UTR变短，可能会失去某些降解信号或miRNA结合位点，从而变得更稳定；反过来，3'UTR变长也可能引入新的调控位点，使mRNA更容易被调控或降解。

02 APA影响翻译效率

3'UTR上的调控元件可以影响核糖体翻译mRNA的效率。APA改变3'UTR后，可能让同一个基因在蛋白水平上产生完全不同的输出。

03 APA与发育和细胞分化有关

不同组织、不同发育阶段，细胞选择poly(A)位点的偏好可能不同。比如神经系统中，很多基因倾向于使用较长的3'UTR，从而获得更精细的空间和时间调控。

04 APA与疾病密切相关

在肿瘤、免疫疾病、神经系统疾病等研究中，APA都越来越频繁地出现。它可能影响癌基因、抑癌基因、免疫调控因子的表达方式，为疾病机制研究提供新的切入点。

05 APA与动植物

APA作为一种极其基础且保守的转录后调控机制，在动物和植物中都发挥着极为广泛和关键的作用。在动物（尤其是哺乳动物）中，APA深刻影响发育、组织特异性与复杂疾病；而植物中，侧重于逆境适应与开花调控。

六 如何研究APA？

理解了APA概念、机制和作用，那如何检测和验证它呢？根据研究目的不同，常见方法大致可以分为几类。

01 普通RNA-seq

常规二代RNA-seq可以用于分析基因表达，也能在一定程度上推断3'UTR使用变化。比如，如果某个基因的3'UTR近端区域reads很多，而远端区域reads明显减少，可能提示它发生了3'UTR缩短。但普通RNA-seq并不是专门为poly(A)位点设计的，受测序深度、文库构建方式、覆盖均一性等影响，APA分析有时会比较间接。

但是RNA-seq成本低，适合做初步探索。但如果APA是研究重点，最好使用更有针对性的技术。

二代短读长RNA-seq数据，通过数学和算法模型去估算APA的定量情况[3]

02 3'端富集测序

研究APA最直接的思路，是专门去测mRNA的3'端。常见技术包括3'RNA-seq、PAS-seq、Poly(A)-seq、3'READS等。不同方法细节不同，但核心原理相似，富集并测序mRNA的3'末端，从而定位poly(A)位点。

这类方法可以告诉我们，一个基因有哪些poly(A)位点；不同样本中哪个poly(A)位点使用更多；是否发生了3'UTR变短或变长；APA事件是否具有组织或疾病特异性。如果你的研究重点就是APA，这类技术通常比普通RNA-seq更直接。但是，它难以获得完整的转录本结构，且对内含子APA的分析有局限。

03 全长/长读长转录组

另一类思路是直接读取更完整的转录本。全长转录组可以帮助我们看到一条转录本从5'端到3'端的整体结构，因此不仅能观察poly(A)位点，还能同时看到它和可变剪接之间的组合关系。这点很重要。因为真实的转录本不是只有“剪接”或“APA”一个维度，而是多个加工事件共同形成的最终产物。

长读长数据更适合回答这类问题：某个APA位点对应的是哪一种完整isoform；APA是否和特定可变剪接事件绑定出现；一个基因到底产生了多少种完整转录本；是否存在过去注释中没有的新转录本。

04 RT-PCR/3'RACE

如果高通量分析发现了一个感兴趣的APA事件，后续通常需要实验验证。常见验证方法包括：

RT-PCR/qPCR：可以设计针对近端或远端3'UTR区域的引物，比较不同样本中的相对使用情况。

3'RACE：可以专门扩增mRNA的3'末端，用于验证poly(A)位点位置，尤其适合确认某个具体基因的APA事件。

当然，也有利用CRISPR编辑进行功能验证。此外，也可以进行单细胞水平的APA解析。

总结一下。

想大范围发现APA：用测序；

想确认某个具体事件：用PCR或3'RACE；

想看完整转录本结构：用长读长转录组。

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