植物单细胞测序如何设计样本和验证 | 单细胞图谱篇

原创于 2026-06-24 11:53:13 发布 · 337 阅读

7 ·

本内容遵循CC 4.0 BY-SA版权协议

GEO检测

收录于

干货类

单细胞测序

空间组学

植物单细胞研究的方向有两类：一类是构建细胞图谱，回答“植物组织由哪些细胞组成”；另一类是围绕发育、生物/非生物胁迫、细胞命运转换、细胞通讯和基因调控网络展开，回答“不同细胞如何参与某个生物学过程”。

在植物单细胞研究中，细胞图谱的构建无疑是最基础、也最直观的一类经典设计。然而，回顾近两年的顶刊文献，植物单细胞图谱研究发生了比较大的变化。早期的单细胞图谱几乎是模式植物（以拟南芥为主，以及早期的水稻、玉米、大豆）的天下。而随着技术的进步，近两年单细胞图谱研究呈现出明显两类情况。

1 模式植物

在拟南芥、水稻等模式物种中，单纯测一个器官、一个时期的常规图谱已经很难打动审稿人。模式植物的实验设计正深度走向“多器官跨时间全景（如覆盖10个发育阶段、百万细胞核级的生命周期图谱）”、“单细胞多组学/空间多组学整合”或“跨物种解析”。

2 非模式/特种植物——“图谱型研究”的红利暴发期

与此同时，图谱型研究的红利正以惊人的速度向非模式植物、大田作物和特种经济/药用植物（如茶树、辣椒、马铃薯等）转移。对于这些物种而言，“画出第一张单细胞图谱、定位次生代谢产物的合成细胞、解析木质化过程”本身就是极具演化和应用价值的重磅发现。

我们来结合案例看看，当下单细胞图谱研究是如何进行样本设计和结果验证。

案例一水稻多器官单细胞多组学图谱

标题：A single-cell multi-omics atlas of rice

链接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-09251-0
发表期刊：Nature
发表时间：2025
样本设计：水稻8类器官（茎尖生长点、旗叶、茎秆、冠根、种子、穗、叶、分蘖芽）
研究技术：scRNA-seq和scATAC-seq单细胞多组学
主要内容：研究首次对水稻8个器官的11.6万个细胞进行同步染色质可及性（ATAC）与基因表达（RNA）的单细胞多组学测序，构建了全球首个水稻单细胞多组学图谱，系统鉴定了54种细胞类型，发现了新的细胞状态（如花分生组织“过渡态”），并揭示了RSR1、F3H和LTPL120等关键基因在细胞类型特异性调控及农艺性状形成中的核心作用。
验证实验：

（1）原位杂交：用于细胞类型定位验证，比如用于验证主要器官的细胞类型标记基因。

（2）基因编辑与突变体表型分析：用于核心基因的功能验证，使用了CRISPR-Cas9技术构建功能基因（rsr1, osf3h, osltpl120, osra2, oserf82等）突变体，然后对突变体进行形态测量、生理指标、生化与细胞学检测以及转录组分析。

（3）突变体的单细胞转录组测序：用于在单细胞水平验证基因功能。以osltpl120突变体为例，研究不仅观察了宏观表型，还对其根部细胞进行了scRNA-seq，对比野生型和突变体的单细胞图谱。

图：水稻各器官中的单细胞多组学数据图谱

案例二跨物种单细胞图谱揭示了与维管植物主要细胞类型相关基因

标题：A unified cell atlas of vascular plants reveals cell type foundational genes and accelerates gene discovery

链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.07.036
发表期刊：Cell
发表时间：2025
样本设计：跨物种研究，涉及拟南芥、水稻、油松、肾蕨、珊瑚卷柏、石松6个物种
研究技术：scRNA和scATAC-seq
主要内容：研究通过构建涵盖六个代表性维管植物物种（从石松类到被子植物）茎尖的单细胞转录组图谱，并开发无参考基因组的分析流程，首次在宏观进化尺度上实现了跨物种单细胞整合，揭示了保守的细胞类型基础基因，并利用这些基因加速了韧皮部发育新调控因子的发现。

验证实验：

（1）细胞类型标记基因验证：研究中有用到RNA原位杂交、单分子荧光原位杂交和组织学与显微技术验证。比如说，利用RNA原位杂交验证新构建的各物种（油松、肾蕨、卷柏）细胞图谱中预测的细胞类型特异性标记基因，将计算聚类结果与组织空间位置对应；

（2）功能验证：主要利用T-DNA插入突变体和CRISPR-Cas9基因编辑技术构建突变体，然后对突变体进行表型观察、生理生化指标检测、扫描/透射电镜观察细胞结构、RNA-seq分析基因表达水平。

（3）启动子-报告基因融合：构建pSECB1::GFP载体，转化拟南芥，确认SECB1基因在发育韧皮部中特异表达，其蛋白在筛分子周边呈不连续分布。

图：以单细胞分辨率整合维管植物茎尖细胞图谱

案例三辣椒发育的时空细胞图谱和植物代谢空间调控

标题：Laminar patterning transcription factors orchestrate spatial metabolite partitioning in Capsicum fruit

链接：https://doi.org/10.1038/s41477-026-02293-w
发表期刊：Nature plants
发表时间：2026
样本设计：辣椒57个组织，跨发育周期：萌发1天的下胚轴，第1周和第3周的根、茎、叶，茎尖分生组织，花，以及7个发育关键时期的果实。
研究技术：snRNA-seq和空间转录组
主要内容：辣椒产生辣椒素和辣椒红素等重要代谢物，其生物合成途径已较清楚，但空间调控的细胞架构仍不明确。研究通过整合单核RNA测序与空间转录组学技术，构建了辣椒发育的时空细胞图谱，揭示了层状模式转录因子（LPTFs）通过调控细胞类型特异性基因表达，驱动辣椒素和辣椒红素在果实不同组织层中空间分区的分子机制。
验证实验：

（1）细胞类型注释的空间定位验证：通过RNA原位杂交对标记基因的空间定位进行了直接验证，证实了细胞类型空间注释的准确性。比如，标记基因PDF1定位于内果皮与外果皮。

（2）功能验证：单分子荧光原位杂交(smFISH)证实代谢活跃的腺体中MYB31和WRKY9在转录水平上呈现显著富集，并具有明显的分层表达模式。

（3）功能缺失验证：沉默候选基因，观察表型，检测沉默株系果皮中辣椒红素含量；RT-qPCR检测靶基因和辣椒红素途径关键基因的表达水平。

（4）分子互作与调控活性验证：酵母单杂交证明ZAT10可结合PSY1启动子，BTF3可结合CCS启动子；双荧光素酶报告实验证明ZAT10可增强PSY1启动子活性，BTF3可增强CCS启动子活性，为LPTFs的直接转录调控提供了证据。

图：辣椒的时空单核细胞及空间转录组图谱

案例四白菜春化时间单细胞图谱

标题：Time-resolved single-cell atlas identifies the spatiotemporal transcription dynamics in vernalization response in Brassica rapa

链接：DOI: 10.1016/j.celrep.2025.115725
发表期刊：Cell Reports
发表时间：2025
样本设计：选取五个不同春化时间点，冷处理第0天（样本NV）、第7天（样本V1）、第14天（样本V2）、第21天（样本V3）及第28天（样本V4）的叶片。
研究技术：scRNA-seq
主要内容：通过对大白菜冬性品系5个春化时间点的叶组织进行scRNA-seq，绘制了春化过程的时间分辨单细胞转录图谱。叶肉细胞在低温条件下表现出最显著的基因表达变化，而维管组织则显示出较高的开花相关基因表达水平。叶肉细胞轨迹分析表明，在春化过程中，白菜型油菜植株对低温胁迫呈现双相响应。组织范围内的BrFLC表达变化源于表达细胞比例的变化，通过数字化的细胞反应支持了春化作用的数量特性。该研究为春化过程中开花的时空调控提供了宝贵的资源和见解。
验证实验：FISH空间原位验证BrFLC表达的空间定位。

图：基于单细胞RNA测序技术对白菜叶中细胞聚类及细胞类型鉴定

案例五拟南芥衰老图谱

标题：Time-resolved single-cell atlas identifies the spatiotemporal transcription dynamics in vernalization response in Brassica rapa

链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.03.024
发表期刊：Cell
发表时间：2025
样本设计：拟南芥20个组织（从营养生长到生殖生长的全生命周期），根、茎、茎生叶、6个时期的莲座叶、生殖器官（从花蕾-角果的9个时期）等。
研究技术：snRNA-seq
主要内容：研究利用来自20个组织、涵盖多个发育阶段的逾100万个细胞核，构建了全面的拟南芥单细胞核转录组图谱。研究鉴定出此前单原生质体研究中未被表征的细胞类型，揭示了不同器官间细胞类型的保守性与特异性。通过时间分辨采样，研究发现了叶片主要细胞类型中衰老过程的高度协同起始与进展。研究首创了两个分子指标（SAG-index/YAG-index），可在单细胞分辨率下量化叶片细胞的衰老状态。此外，借助加权基因共表达网络分析，研究鉴定出数百个可能协同调控叶片衰老的潜在枢纽基因。在已鉴定枢纽基因功能验证的启发下，研究构建了从源叶到库器官不同细胞类型间碳氮分配的体系化场景。
验证实验：

（1）空间转录组验证细胞类型注释的准确性，对茎使用空间转录组获得空间基因表达矩阵，通过TransferData将snRNA-seq cluster标签映射到空间切片上。大多数细胞类型的空间分布与已知解剖结构吻合。

（2）转基因标记线验证，挑选在S3期SAG-index top 5%细胞中高表达的基因RPGE2，克隆其基因片段，构建融合表达载体。结果显示GFP信号散布分布于整个叶片，但更倾向于聚集在叶尖区域，与SAG-index预测的“叶尖优先启动衰老”一致。

（3）突变体功能验证，比如说验证snRNA-seq发现的细胞类型特异性转运蛋白是否参与衰老过程中的养分再分配。从AraShare购买候选转运蛋白的T-DNA突变体，同样进行叶色、叶绿素含量和衰老标记基因的RT-qPCR分析。突变体（sweet12, stp3, stp4, stp7, stp13, stp14, umamit20, umamit29, umamit40）均表现出延迟衰老表型。

（4）跨物种分析验证：研究还检验SAG-index和YAG-index是否适用于其他双子叶植物。下载已发表的杨树叶片发育时间序列bulk RNA-seq数据，提取与拟南芥核心SAGs/YAGs具有高蛋白序列相似性的同源基因，按相同公式计算SAG-index和YAG-index。