原核蛋白表达纯化全流程＆实验讲解_原核蛋白表达菌体和上清蛋白-CSDN博客

💡原核蛋白表达是快速获得足量纯蛋白的核心手段，直接决定后续蛋白功能、互作、抗体、酶活等关键实验能否顺利开展。

📢原核蛋白表达实验结果不确定性较高，常出现不表达、形成包涵体、诱导后电泳条带模糊等问题，既耗费实验时间，也消耗试剂耗材。现整理了实验总结的干货，分享给大家~

1️⃣先搞懂：什么是原核蛋白表达？

简单说就是“借细菌的手造蛋白”。最常用的就是大肠杆菌（周期短），把我们要的目的基因插进载体，导入细菌后，诱导它大量合成目标蛋白，最后纯化出来用于实验

适用场景：抗体制备、酶学分析、蛋白结构研究，不需要复杂糖基化修饰的蛋白首选它

2️⃣科研党高频踩坑｜快速避坑

❌ 质粒测序正确，蛋白却不表达？

大概率是稀有密码子太多，换菌株，或做密码子优化，也可以试试融合表达载体

❌ 诱导后细胞停止生长，以为细胞死了？

别慌！诱导后，细胞会全力合成蛋白，停止生长但没死亡，属于正常现象

❌ 目的蛋白全是包涵体，没法用？

降低IPTG浓度（0.01-0.1mM）、延长诱导时间，或换菌株促进二硫键折叠；实在不行就做包涵体复性，帮助蛋白重新折叠

❌ 化后蛋白大小不对？

可能是蛋白水解或翻译提前终止，建议用两端带标签的载体（如pET-28系列），洗脱时提高咪唑浓度区分全长和截短蛋白

3️⃣✨新手必看小技巧

▪️ 新手先做小量预实验，摸索温度、IPTG浓度和诱导时间，再放大培养，避免浪费

▪️ 超声破碎一定要冰浴，加蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解

▪️ His标签被包在蛋白内部？适当提高变性剂浓度，或加大DTT浓度，让标签暴露便于纯化

▪️ 不用追求100%可溶性，包涵体虽然要复性，但纯度高、能避免蛋白酶降解，也是不错的选择

其实原核蛋白表达没有那么难，找对方法、避开坑，重复几次就能稳定出结果✅

原核蛋白表达是快速获得足量纯蛋白的核心手段，直接决定后续蛋白功能、互作、抗体、酶活等关键实验能否顺利开展。

实验步骤

1.载体构建：将目的蛋白的CDS序列构到带有标签的目标载体上（如pET28a等），载体的标签常用His或GST，方便后续纯化。将构好的pET28a载体转化到大肠杆菌BL21菌株中，将转化好的大肠杆菌试管中进行摇菌，37°C摇床过夜 (抗生素最终浓度为50μg/mL）；

2.诱导表达：将上述小摇菌液4mL以及相应体积抗生素加入到400 mL液体LB培养基中，37°C摇床中摇至 OD=0.6-0.8(约3-4h)，加入IPTG，20°C摇床中诱导10-12h；5000rpm 10min收集菌体，去上清；加入30 mL1xPBS重悬菌液后离心5000 rpm 10min，去上清，加入70 mL1xPBS将菌液悬起，放冰上加蛋白酶抑制剂或还原剂（根据标签性质选择）；

3.菌体破碎：

（1）压力破碎：高压均质机进行菌体破碎，破碎菌液至略澄清状态(500-800Bar，3-4min)，泄压，收集菌液。12000 rpm 4°C 15min离心，上清过0.22μm无机膜后放到干净的50mL离心管中；

（2）超声破碎：将样品放于冰上进行超声破碎，超声功率35 W，超声 3 s，间隔 3 s，总时间60 min；

4.收集：将对应标签的Ni-NTA 树脂300 μL吸到1.5 mL离心管中，短暂离心后用1 mL移液枪吸出上清，加1mL PBST(Tween 20:1xPBS为1:1000)短暂离心洗出上清，洗珠子三遍后加到过无机膜的含蛋白的50 mL离心管中，4°C过夜旋转孵育结合；

5.纯化洗脱：

（1）将过夜后孵育的珠子4°C1000-2000 rpm 5 min离心后珠子聚集在管子底部，倒掉大部分上清后过收集柱，用Washing buffer 5 mL洗掉管子中残留的珠子并倒入收集柱中，用1.5 mL离心管收集从收集柱流下的第一管Washing液体约1 mL，每次5 mL Washing buffe，洗 3-4 次；

（2）每次加1 mL Elution buffer，加3次，每次洗脱液都要分别收集到1.5 mL离心管中(放冰上)

6.检测：通过SDS-PAGE以及Western blot检测纯化后的蛋白

将洗脱的四管样品分别用两块10 %蛋白胶通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离蛋白；一块蛋白胶用考马斯亮蓝染5-10min，洗脱液洗至能清楚看到蛋白条带，比对大小即可；另一块杂抗体，显影。

原核蛋白表达实验可以将植物蛋白通过大肠杆菌在体外表达出具有活性的蛋白，纯化后蛋白的纯度、浓度以及活性直接影响着后续实验的结果。

那么，原核蛋白表达后续可衔接什么实验呢？基本是一些体外的实验，如Pull down、EMSA、体外磷酸化、SPR等。

原核蛋白表达&Pull down

Pull down是一种体外亲和纯化技术。该技术通过把X、Y两种蛋白在体外分别表达纯化后混合到一起，过蛋白X的抗体柱后，洗下柱子上的蛋白样并检测其中是否含Y。若X能把Y拉下来(即Pull down)，说明它们有直接相互作用，反之则无。 X、Y蛋白的标签是不同的。

如若蛋白表达纯度过低，其他杂蛋白可能会干扰互作结果；若浓度过低，即使互作也可能会因浓度问题导致结果检测不出；若蛋白表达出无活性，会直接导致实验结果错误。

原核蛋白表达&EMSA

凝胶迁移阻滞实验（EMSA）基于DNA-蛋白复合物与游离DNA探针在非变性凝胶电泳中的迁移率差异。通过生物素/荧光标记探针和竞争性结合实验，可直观验证蛋白-DNA相互作用的存在及特异性。

1.验证型EMSA

2.竞争型EMSA

通过原核表达系统获得高纯度活性蛋白，为 EMSA 实验提供核心材料，以验证转录因子与靶基因启动子的体外结合能力。

针对目前常见的EMSA类型分两种，其中竞争型EMSA是文章中应用较多的，泳道组合设计是关键，用来验证蛋白和DNA探针的特异性结合以及结合位点。

原核蛋白表达的蛋白质量直接影响EMSA的实验结果。

体外磷酸化实验

体外磷酸化实验是在体外模拟体内蛋白激酶催化的磷酸化反应，通过纯化蛋白 / 激酶、ATP（磷酸供体）及适宜缓冲体系，在受控条件下实现蛋白磷酸化，并检测其修饰状态与位点。

Phos-tag SDS-PAGE是一种磷酸亲和电泳技术，可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。Phos-tag是一种能与磷酸基团特异性结合的化学试剂，核心结构是一个金属离子（如 Zn²⁺ 或 Mn²⁺）配合物，可选择性结合蛋白质上的磷酸化氨基酸（如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸），使蛋白迁移率变慢。