靶基因高通量测序建库流程介绍

高通量测序简单介绍：

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

测序平台主要包括：454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing），等。现在二代测序的主流平台是illumina。

下面介绍靶基因的illumina平台建库流程：

一、基因组DNA的抽提

遗传信息绝大部分存在于基因组DNA中，所以建库的第一个步骤就是抽提基因组以获取纯度较高的DNA，用于后续实验，如PCR、测序、生物鉴定等。

目前针对不同类型的样本，都有对应的试剂盒。微基生物对于特殊类型的样本（皮肤样本等痕量微生物样本，或是组织等高宿主背景的样本等），也开发了自己的特有的抽提方法，以便增加基因组DNA的抽提效率。

二、基因组DNA的质控

基因组DNA采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，是目前常用的一种检测方法。琼脂糖凝胶电泳法检测DNA，主要是基于分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。

三、设计并合成引物接头

illumina二代测序主要是针对靶基因进行测序。一般目的片段在450bp以内的可以采用PE250双端测序，测序结果可以进行拼接后分析。如果片段长度大于470bp，采用PE250测序后只能采用单端测序结果进行后继的生信分析。

根据illumina高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有“5’接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并采用两步PCR扩增的方法构建文库。