�ϳ��豸
hcyq.ybzhan.cn�DZ�������01
ʲô��SPOT�ϳɣ�
What is SPOT synthesis?
SPOT ������ Ronald Frank �����������ھ���Ĥ�����ϵIJ�ͬλ��ͬʱ�ϳɶ��ġ��ü�����ԭ���ǽ�Ԥ��İ������������СҺ�η��䵽���Ĥ��Ԥ�����λ�������ϡ�Һ�α����ղ��γɵ����ķ�Ӧ�ң����ڹ���ϳ��еĻ�ѧ��Ӧ��������ͬ�ĵ����������һ��Ĥ�ϣ�������Щ���е�ÿһ��������ͨ����Ӧ�Լ���Һ���ֶ����Զ�����������������ÿ������ĵ����͵��С��Ĥ������������Һ�ε�������������ݻ��ʵ��ض����ܣ����С��ϳɵ��ض���ģ��ء� Ronald Frank ���ʹ�õ���Ĥ��Ȼ��ީ�ܻ�ӭ�����壬�ɸ�����ά����ֽ�Ƴɡ�
�� MultiPep 1&2 �ϳ����Ϻϳ���������һ�ִ��������ĵ������ҷ���ķ���������ͨ���������Һ�εij�������ά��Ĥ֧�����Ϻϳɡ���֮ǰ��ȣ�Ĥ�Ͱ�������֮��ļ������ȶ����ϵõ��˸����������ڶ� 100% �����������ȶ��������ڼ��������½������鲻�ᵼ������ʧ���ü����ܱ��и����ͷ��ġ��ı��ֹ������ӣ�������Խ����������ơ��м��ַ������Ի�ȡ�йغϳ���������Ϣ��
02
�ϳ����λ����
Synthesize and analyze some epitopes
����������һЩ��֪������ǰ����Ŀ�������õ��ģ�����Ҳ��Ҫ������һЩ���塣һ�ָ��ķ�����������ù����ʶ��� Strep-tag��Ȼ�����ʹ��ͨ�õ���ù���ر���ż������м�⡣ͨ���ض̱�λ����ʵ�ֲ�ͬ���ź�ǿ�Ȼ�������Strep-tag II �����������ǣ�NWSHPQFEK�����ҿ��Լ�������һ�������е� HPQ ���ġ�
03
��ϱ������
Couple a reporter molecule
ͨ����ÿ���ϳ������ж���һ�����������裬�ò���Ӧ�ⶥ����δ��Ӧ����������������صĺϳ����⣬�ں���ĺϳɲ����оͻ���������ķⶥ�������������κ�����İ�������ˣ�N�˵ı�����ӽ������ֺϳ��������ġ����õı��������
��ţ���أ��ü���ͨ��ù����-�������������
��ù���ر��湲����Ҳ�ܼ� N �˵���ù��ǩII(NWSHPQFEK)��
����Ⱦ�ϣ�����һ��������ϣ����չ������¿ɼ�
04
�ںϳɹ����н���һЩ���
Perform some checks during synthesis
�ֲ��н������ںϳɹ����й۲����백�������Ⱦɫ���衣�����֮������Һ��û�м���������������� DMF �еļ�ϡ����Һ��1% ��Һ��1:100 ϡ�ͣ���Ĥ����Ⱦɫ���ߵ�Ӧ��ʾΪ����ɫ����ǿ�������ж��仯���ɽ���ĤӰӡ����ӽ�ü�¼һЩ��صĺϳɲ��衣��������ʹ���ֳ�ʽ��������۲�ϳɺ���ġ��ر���ɫ���ω�����������������»ᷢ�⡣��������ƺ��������Ҽ۸���ˡ�ͨ���ɿ���ѧ��ʹ�û������鳮��
��ͼΪ�̲��� LUYOR-3410 �����ߵ������¹۲쵽��Ч��
05
����һЩ�ο���
Analyze some reference peptides
�������г������ߵ㣬������а�������������á���Ϣ��������ʿط����� MALDI ��������һЩ���� C ���� Lys-Gly ��β�������������ѱ��������°ߵ㣬���ȵ�����ÿȥ���ġ������õ�����Һ�м�ʹֻ�аٷ�֮�����ı��ͷų�����Ҳ���Խ��� MALDI��������ע�⣬����������� Lys�� Arg �л�����Ҳ�����ڲ����жϡ�����ڵ�һ��ѭ��������һ�����ѽ��������(�� Rink ����������)���������Ķ������÷�ʽ֬�����ͷų���������������£������ڲ����ѱ���֮ǰ�����и�����������������ͷŵ���Ҳ�������� HPLC ������
06
һ��������
General remarks
SPOT �ϳɵ�����Ķγ���Ϊ 10 �� 25 ���л�������������Ⱥ������ͻ������½�����Ϊ�������е����������������롣���� RudolfVolkmer С�����ϸ������ʾ����ά��������õ������������������� 50 ���л��ij��ȡ�����������£�ͨ�� Fmoc-�� Boc-beta- �����ω��������ϣ�Ĥ�ij�ʼ����������Ӧ���� 10-100 �����ĵ�ԭʼ������ͨ���ȿ���������ĸ������߳�����������������ֻ�к��ٵ���ȷ�����ܱ�������ˣ���ÿ���ϳɲ����в������õķ�˳���ͨ�����������Ļ����˽��пɿ��İ�������䣬�� N ��ʹ�ñ���Ⱦ�ϾͿ��ԶԺϳɳ�����м���֤�����˷��ġ�
07
ʹ���ֿ��������Ӽ����� SPOT �ϳɵ���������
QC on SPOT synthesis using a Rink amide linker
�� MultiPep 1&2 �ϳ����Ϻϳ���������һ�����۶�����Ĵ����ϳ��ĵķ�����������ͨ�������������Һ������ά��Ĥ֧���Ϻϳɵġ����һ�ݳ�������ȣ�Ĥ���һ����ϰ����Ṧ��֮��Ľ���ȶ���������ߡ����ڣ����� 100% �ķ�ʽ֬���ᶼ���ȶ����ڼ��������½��м��Ҳ���ᵼ���ĵ���ʧ�����ּ����ܱ��ѽ����ͷ��ģ����DZ��ֹ������ӣ���˺��ѽ����������ơ�����ڵ�һ��ѭ���������˿��ѽ������壨�� Rink ���������壩���������Ķ������÷�ʽ
֬�����ͷų���������������£������ڲ����ѱ���֮ǰ�г��õ㲢����������
�������:
1. ���������ֲ����úϳɡ�
2. �ںϳɵĵ�һ��ѭ���У��� FMOC-Rink ��������������������ʿ��ġ�***�ʿ��Ŀ���Ĥ�Ǹ����ϳɣ��Ա���ȥ����
3. �ϳɺ�������ȡ�¸����Ĥ���۲�ߵ�
ʹ���ֳ�ʽ�����ߵ�������������һ�㡣Ȼ����Ǧ��Ȧ���ʿص㣬�ٴ�Ĥ�ϼ��¡�
���ߣ�Ϊ��ʹ�ߵ����ֳ������ɽ�Ĥ������ DMF ��Һ�е�1% ������С��ߵ�Ӧ���ֵ���ɫ����ǿ�������ж��仯��
4. �����µ��ʿص���� 1.5 mL �����������Ĺܣ��������Թܣ��У����� 150 uL ͨ���ѽ��������ѡ�������ǽ��Թܸǣ����� 2-4Сʱ���⽫ʹ�ĴӸ��Ե��ֿ��������������ѽ⣬��ȥ�������������š�
5. ���������ѽ���ĵ�����Һת�Ƶ�һ���µ������Ĺ��У�������װ�����ðߵ�����Ĺܡ�
6. ʹ�ñ�ʵ���ҳ�����Һ�������Ӧע��ǿ���ʵ�����豸����
7. �� 10 uL 0.1 % �ķ�ʽ֬�������ܸ��ġ�
8. �Ը���Һ���� MALDI����������һ��Ϊ1��L ����١�(ע�� MWΪ -1)
ע������������(TFA)��һ�ֻӷ��Ժ�ǿ���ᡣ�����ѽ�ͼӹ����̱�����ͨ����н��С��ڴ˽α��������ȫ�۾������Ͱ״�ӣ����������а�ȫ�涨�����з�����밴�չ��ҹ涨���д�����
ͨ���ѽ�����
92.5%(vv)������������TFA
5% (v/v) �����������
2.5% (vv) ˮ
���ڿ��ѽ��� Fmoc ������
Su et al.
Epigenetics&Chromatin volume 7, Article number:7(2014)����� PTM �鵰�������кϳ�ʹ�� RespepSL �Զ��ϳ���(Intavis AG��KoIn��Germany,MultiPep 1CEM)�ڸ�����ά���Ϻϳ��ġ���Fmoc�� celluspot ���Ƴ������ Cy3(Lumiprobe,��˾)�͵õ�����ά��-Cy3 Ⱦ�Ϲ���İߵ���ա��հ�ϸ��ɫ�߶�������ͨ��ȥ��ɫ���ϵ� Fmoc ������ֽ�����ܽ������¶��Ƴɵġ������ģ���ʼż��������Ħ������Fmoc-Ala-OH �� Boc-Ala-OH���Լ�����֬���ز���ߺϳ�������ÿ�κϳɵ��Ķ����пɱ����ѽ�����ڣ��Ա�ͨ����ЧҺ��ɫ��������������������(�����ļ� 12:�� S2)����������� 20 ԭ�ӵľ���ϩ������(PE)(Novabiochem ��˾)������ߺϳ�Ч���������еĵ����ʽ������Fmoc-Glu-(biotinyLPEG)-OH(Novabiochem)����ù���صĶ��ա�
ʹ�ñ��� Fmoc/tBu ��ѧ�������� 13 �������ġ���ǰ������ [24]���ĵ� PTM ���ʵ������ĵ�����ʽ���롣�ϳ���ɺ��� 82.5% ����������(TFA)ȥ��������������:5% ���������5% ˮ:5%���ȼ����еı��ͱ��Ϸ�:2.5%����������� 90 ����(ÿ����150��)��ȡ����Һ������ 250 �̵� 88.5% ��ʽ֬���ᡢ4% �������ᡢ2.5% ������������ 5% ˮ����������ҹ���ܽ���ά�ء�����Ķ������Գ�������ά�ع��������Σ����ɼ����ӣ�Ȼ�������ܽ100�� �Ķ�������(DMSO)�С�
Boisguerin et al.
Chemistry & Biology, Vol. 11, 449�C459, April, 2004���������� PSD-95 PDZ3-�ṹ���ϵĶ��� NYKQTSVCOOH ���������ѻ�����Ч��[148]������������(10)(�������� 10-12 �ο�ͼ 3.5 (A))���ڼ������ѽ���Ϻϳɵ�(ͨ������Fmoc-Rink ������ʵ�ֿ��ѽ���)��3 Сʱ���÷�ʽ֬���Ὣ�IJ��� h-1��h-2 �� h-3 �ӵ����ѽ⣬���� HPLC �� ESI-MS ���з���(ͼ 3.5 (B))���Է�Ӧ����ķ�������ر������� h-3 �����£�����-������Ӧ��Ч�ʺܸߡ�Ϊ��ȷ�������жԻ���!��������Ӱ�죬�����ֺϳ�������Ĥ�������������:EFHAALGSYVCOOH�� QHIDSQKKACOOH��
���ڵ�ϳɵij�������
1. SPOT �ϳɵ�ʱ����ʲôʱ��?
ʹ��˫ż�������ϳ� 4x384 ��ʱ��ÿ��������Ҫ 2 ��Сʱ���������Ҫ 2-3 ��Сʱ��ÿ�����ڵIJ���ʱ��ԼΪ 30 ���ӣ������Ʊ��������������ϴĤ��
2. Ĥ���ĵ��ܶ��Ƕ���?
���ܶ�Ϊ 10x15 ������ά��ĤƬ�� 600 �����������ĵ����ĵľ���Ϊ 4.2 ���ס�Ҳ�������ɶ������������ڷdz��ܿص������£���ά��Ĥ�ϵ��ܶȿɴ� 25x40 ���㡣
3. һ�����ж�����?
�����ṩ��Ĥ�����������������백���ĸ�����ԼΪ 300-400 nmol/cm2��ÿ���ߵ�ĸ�������ͨ���������ó���
����:һ��ֱ��Ϊ6���ĵ�Լ�� 80 ��Ħ�����ģ�һ��ֱ��Ϊ3 ���ĵ�Լ�� 20 ��Ħ�����ġ�
4. �� CelluSpots �ϳɹ����У�Ӧѡ������Ʒ�Ƶ���ֽ���ڿ����?
����ʹ�� Whatman 540 �� 541
5. ������������������ںϳ�?
��ȡ Fmoc-LyS(Ac)-OH��CAS#159766-56-0���������� MultiPep 1&2 ��ͬ�ı�ż����������ż����
6. Ahx���Ӽ�����ˮ�Զ�Ӧ����ʲô?
����ʹ�� Fmoc-8-����-3,6-���������ᡣ
7. ������С��ģ�˰�ϳɵIJ���?
ʹ�� Ramage ��֬(PC-01-0601)����С�����ѽ⼦β�ƿ������ѽ��ġ�
8. ���ʹ�� MultiPepRSi �� RespepSL �ϳ� PNA ʹ����������:
PNA ���壺0.3M �� NMP ��ʹ������ż����
�����HATU �� PyAOP(0.6M ��Һ);HATU ���ȶ���PyAOP Ӧÿ����¡�
�����DIPEAV2,6-lutidine(1.2/1.8M��DMF ��)�����ּ��� DMF �еĻ�ϱ���Ϊ20.09%(vvv)��
9. ����������?
�����кϳɵ����У���������Լռ 1%����������ʹ�ĸ����ȶ����Ӷ����´����۵����������ω���鰱�ω�ᷢ�����������鰱�ω��� 50C ����ߵ��¶��º���������������DIC �� OxymaPure ����Ͽɼ�����������PyOxim �� NMM ����ϸ������������������� HBTU �� NMM ����ϡ�
10. ��μ����ѱ����������춬������γ�?
�������ϳɹ����У��� 20% ������� DMF���� 0.1M HCOOH���ж� Fmoc ���Ž����ѱ������Ա����춬���ǰ�����Ӧ��
11. ��δ� SPOT Ĥ���ѽ����?
ʹ�� Fmoc ���Ӽ���Ϊ��һ�������ᡣ�г�����ĵ㲢Ϳ���ѽ�Һ��Rink-Linker �������ѽⲢ���� C ��������
12. �ҵ� SPOT ������һ���� N ���������������ˡ���α����������?
���һ��������ʹ���嶡���ʻ������ᡣ�������Ա�����ֽ����ֽ�·�ͨ���е��������������������
13. �ܽ��� NMP �İ�������Ա�����?
�����װ��ω�͵������⣬��������Һ���� 4�� �±���һ���¡���ע�⣬�����δ���ʣ������ω�Ȱ��ω�����������
��Ʒ�Ƽ�
������ҵ����
�����ͷ�����: 0571-87759942
��������: 0571-87756399
ý�����: 0571-87759945
Ͷ������: 0571-87759942
�����DZ�վAPP
Ybzhan�ֻ���
Ybzhan���ں�
Ybzhan����