双敏感纳米复合物递送顺铂

利用双敏感智能纳米复合物增强顺铂向肝细胞癌HepG2细胞的递送

摘要

将更高剂量的药物靶向导入并富集于恶性细胞中，有助于增强对肿瘤特异性的细胞毒性。通过自由基乳液聚合方法合成了双响应性纳米凝胶聚(N‐异丙基丙烯酰胺)‐co‐聚(N,N‐(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯) [P(NIPAM‐co‐DMA)]，其中包含作为热响应单体的N‐异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、作为pH响应单体的N,N‐(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯（DMA）以及作为交联剂的亚甲基双丙烯酰胺（MBA）。在凝胶化后，通过将磁性Fe₃O₄纳米颗粒（MNPs）物理嵌入水凝胶基质中，将顺铂与磁性纳米颗粒共同载入该纳米凝胶，从而获得载药磁性纳米复合物[P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄]。在不同温度和pH条件下体外评价了顺铂负载的P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶和P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物的载药效率及顺铂释放曲线，以实现可控药物递送。最后评估了P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物对人肝HepG2细胞的抗癌活性。纳米凝胶和纳米复合物在40 °C时相比37 °C、在pH 5.7时相比pH 7.4表现出显著更高的（p<.05）顺铂释放量，分别证明了其温度和pH敏感性。药物空白纳米凝胶在HepG2细胞系上的细胞毒性检测表明该纳米凝胶具有良好的生物相容性，适合作为药物载体。此外，MTT实验显示，与游离顺铂相比，顺铂负载的纳米复合物对HepG2细胞表现出显著更强的细胞毒性（p<.05）。

关键词 ：纳米凝胶；纳米复合物；顺铂；肝癌；药物递送系统

引言

顺铂（cis‐diamminedichloroplatinum (II) (CDDP)）是一种用于治疗实体瘤的化疗药物[1,2]。当其进入细胞并与脱氧核糖核酸（DNA）结合后，发挥生物活性[3]，但顺铂表现出显著的剂量相关性副作用，如肾毒性、神经毒性、恶心和呕吐[4]。为了保持疗效，提高药物在肿瘤细胞中的积累并实现靶向递送，同时减少顺铂的不良反应，研究人员设计了基于纳米颗粒的药物递送系统[5,6]。

纳米载体系统的纳米尺度大小使得药物在实体瘤中具有通透性和滞留性。由于实体瘤血管结构紊乱且缺乏有效的淋巴引流，大分子和纳米颗粒在肿瘤中的积累多于正常组织（EPR效应）[7,8]。在各种药物纳米载体中，合成聚合物纳米颗粒因其优异的性能而受到更多关注，这些性能包括良好的生物相容性和生物可降解性，尤其是易于进行化学修饰或表面功能化[9,10]。

大量此类纳米颗粒可响应多种刺激，例如温度[11]、磁性[12]、光[13]、pH值[14]、酶[15]、葡萄糖[16]等。这些被称为“智能”或“刺激响应性”[17,18]。将刺激响应性引入合成聚合物纳米颗粒可带来更好的治疗应用。聚(N‐异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）是众所周知的热响应性聚合物之一，在水中表现出低临界溶解温度(LCST)。它在LCST附近发生急剧的线圈–球状相变，此时聚合物在LCST以下可溶，在LCST以上则沉淀[19–22]。

水凝胶是具有物理或化学交联的聚合物链，能够吸收高含水量。亚微米级水凝胶颗粒称为纳米凝胶[23–25]。由于水凝胶具有生物相容性、大表面积和内部网络等优点，再加上PNIPAM的热响应性，使得基于PNIPAM的水凝胶在刺激响应性药物递送系统中得到最广泛的应用[26–29]。这些水凝胶在LCST以下的水介质中溶胀，可将药物载入其内部网络；然而当温度高于LCST时，它们会突然收缩并释放药物[30]。

众所周知，肿瘤中的pH值–由于癌细胞的糖酵解速率较高–低于正常组织。因此，pH敏感性药物递送系统在癌症疾病中得到了最广泛的应用[31–33]。通过在水凝胶合成中使用含有可电离化学基团的单体，介质pH值的任何变化都可能导致其溶胀率等性质发生变化，从而引起药物释放[34,35]。可通过使用pH和温度敏感性单体合成双pH/温度敏感性水凝胶[36,37]。

在本研究中，我们合成了智能纳米凝胶，利用N,N‐(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯和N‐异丙基丙烯酰胺（NIPAM）分别作为pH值和温度响应性单体。对所合成纳米凝胶的结构和溶胀率等性质进行了研究。将顺铂与或不与磁性Fe₃O₄纳米颗粒（MNPs）一起载入纳米凝胶中。我们将磁性纳米颗粒添加到纳米凝胶中以获得磁性纳米复合材料，因为磁性纳米颗粒具有可同时利用被动靶向（EPR效应）和主动靶向的优势；在外加外部磁铁存在的情况下，磁性纳米复合材料可在特定区域聚集，释放药物，从而抑制细胞生长[38–49]。通过透析法在不同温度和pH条件下进行顺铂释放曲线测定，并使用紫外分光光度计进行分析，比较结果。此外，我们还研究了载有顺铂的纳米复合材料对人肝癌细胞系HepG2细胞的细胞毒性。

实验

材料

N‐异丙基丙烯酰胺购自Acros Organics（美国新泽西州莫里斯平原），并通过正己烷重结晶提纯。N,N‐(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯（DMA）、亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和过硫酸钾（KPS）购自默克公司（德国达姆施塔特）。十二烷基硫酸钠（SDS）、磷酸氢二钠和磷酸二氢盐购自Sigma‐Aldrich（密苏里州圣路易斯）。磁性Fe₃O₄纳米颗粒购自美国研究纳米材料公司（美国德克萨斯州休斯顿）。顺式‐二氨二氯铂(II)（CDDP）购自默克公司（德国达姆施塔特）。此外，体外研究还使用了RPMI1640培养基（Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）、胎牛血清（FBS）（Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）、青霉素‐链霉素溶液（Biosera，英国东萨塞克斯）以及MTT（3‐(4,5‐二甲基噻唑‐2‐基)‐2,5‐二苯基四氮唑溴化物）粉末（Sigma，密苏里州圣路易斯）和常规细胞培养器皿。所有其他化学品和溶剂均为市售分析纯。

P(NIPAM‐co‐DMA)的制备

P(NIPAM‐co‐DMA)共聚物通过自由基乳液聚合制备。N‐异丙基丙烯酰胺（3.80 g）、DMA（0.369 g）、交联剂亚甲基双丙烯酰胺（0.125 g，占总单体的3wt%），将十二烷基硫酸钠（SDS，0.05克/100毫升）作为乳化剂和H₂O（230毫升）加入带有磁力搅拌器、冷凝器和氮气入口的500毫升圆底烧瓶中。溶液在室温下脱气30分钟，然后加热至70 °C。将过硫酸钾（KPS，0.166克）溶于20毫升H₂O中加入以引发聚合反应。聚合反应在68–70 °C下持续进行4小时。

聚合完成后，产物在透析袋（分子量截留值为12 kDa，西格玛奥德里奇，密苏里州圣路易斯）中透析一周以去除表面活性剂和未反应分子，每天换水三次。所得共聚物经冷冻干燥后储存备用。

理化表征

P(NIPAM‐co‐DMA)的化学结构

P(NIPAM‐co‐DMA)的¹H核磁共振谱在布鲁克400兆赫核磁共振波谱仪（马萨诸塞州比勒里卡）上以氘代氯仿为溶剂测定。同时采用傅里叶变换红外光谱分析对共聚物进行结构表征。样品的傅里叶变换红外光谱在4000–400 cm⁻¹范围内使用傅里叶变换红外光谱仪（珀金埃尔默983型光谱仪，马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定。

的 1H NMR谱图)

低临界溶解温度测定

为测定P(NIPAM‐co‐DMA)的低临界溶解温度，将共聚物溶液（2mg/ml）完全溶胀后，在紫外分光光度计（岛津2550型分光光度计，日本京都）上于500纳米波长处测量其光学透射率，并记录其在25至50 °C温度范围内的变化。P(NIPAM‐co‐DMA)的低临界溶解温度定义为产生透光率50%时的温度。

的红外光谱)

形态学研究

通过扫描电子显微镜（SEM）研究了含药物与不含药物水凝胶的形态。将一滴样品置于铝箔上并干燥。经薄金层真空镀膜后，在20千伏加速电压下对样品进行观察（MIRA3场发射扫描电镜，泰尚，捷克布尔诺）。

纳米凝胶 (A) 和顺铂负载的 P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物的 SEM 显微照片 (B))

振动样品磁强计（VSM）分析

使用振动样品磁强计（伊朗卡尚梅格纳提斯·达吉高·卡维尔公司）在室温下研究磁性纳米复合物的磁性。

粒径和Zeta电位测量

使用Zetasizer（Nano ZS ZEN 3600，Malvern Instruments，Malvern，UK）在室温下通过动态光散射测量对样品的粒径和Zeta电位进行测定。样品配制成0.5%（重量/体积）。Zeta电位用于表征样品的表面电荷特性。

溶胀行为的测量

采用重量法对共聚物的溶胀性能进行测量。将P(NIPAM‐co‐DMA)样品浸入蒸馏水中，在不同pH值（7.4，5.8）和温度（37 °C，40 °C）条件下放置24小时以达到平衡。用滤纸除去多余水分后，样品称重。溶胀率通过以下公式计算：

$$
\text{Swelling} (\%) = \left[(W_s - W_d) / W_d\right] \times 100
$$

其中 $ W_s $ 是溶胀凝胶的重量，$ W_d $ 是干凝胶的重量。

表1 P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶在两种不同温度和pH值下的溶胀率

载药量

为制备顺铂负载磁性纳米复合物，将100毫克冻干P(NIPAM‐co‐DMA)悬浮于2毫升H₂O中，在室温下溶胀24小时。然后加入10毫克顺铂和2毫克Fe₃O₄纳米颗粒，在0.5周期和50%振幅条件下超声处理15分钟（超声仪，Hielscher，特尔托，德国）。溶液在室温下搅拌72小时，随后加热至高于LCST。收集载药磁性纳米复合物，冷冻干燥并储存以供进一步应用。同样方法但不添加磁性纳米颗粒制备顺铂负载水凝胶。随后使用紫外分光光度计分析上清液，测定未包封顺铂的含量（最大波长295纳米）。利用这些数值计算水凝胶在有无磁性纳米颗粒存在时的顺铂包封效率。

包封效率（EE%）的计算公式如下：

$$
EE (\%) = \left[(\text{初始药物用量} - \text{未包封药物量}) / \text{初始药物用量}\right] \times 100
$$

顺铂释放曲线随温度的变化

十毫克冻干顺铂负载样品在含有两种pH值（7.4和5.8）的8毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的试管中悬浮。溶液随后在37 °C和40 °C温度下孵育。在预定的时间间隔，将试管以18,000×g离心10分钟。然后取出2毫升上清液，使用紫外分光光度计进行分析，并补充相同体积的新鲜PBS溶液。从样品中释放的顺铂浓度以总顺铂的百分比表示，并对时间作图。

纳米凝胶 (A) 和顺铂负载 P(NIPAM-co-DMA)/Fe₃O₄纳米复合物 (B) 的粒径分布，通过动态光散射分析)

/Fe₃O₄纳米复合物（B）的磁化曲线)

/Fe₃O₄纳米复合物的分离‐再分散行为：无外磁场（左），有外磁场（右）)

利用双敏感智能纳米复合物增强顺铂向肝细胞癌HepG2细胞的递送

结果与讨论

共聚物合成与表征

P(NIPAM‐co‐DMA)共聚物通过N‐异丙基丙烯酰胺和DMA在自由基乳液聚合条件下聚合而成，以KPS作为引发剂，MBA作为交联剂。共聚物的结构通过¹H NMR和傅里叶变换红外光谱进行了确认。图1显示了该共聚物的¹H NMR谱图。质子共振的化学位移分配如下（δ ppm）：1.102（CH(CH₃)₂），2.053（CHCO），3.963（CH(CH₃)₂）对应NIPAM，以及2.631（CHN），4.088（CHO），2.295（(CH₃)₂N）对应DMA。共聚物主链的质子出现在1.565–1.970。

共聚物的傅里叶变换红外光谱证实了各组分特征官能团的存在。如图2所示，NIPAM酰胺基的特征峰出现在1640–1660 cm⁻¹。3300–3500 cm⁻¹和1375 cm⁻¹处的峰分别归属于NIPAM中N–H和异丙基的甲基。1735 cm⁻¹处的峰为DMA中羰基的伸缩振动，2950 cm⁻¹处的吸光度带与脂肪族C–H键的伸缩振动相关。

共聚物的热性能

P(NIPAM‐co‐DMA)的低临界溶解温度（LCST）通过透射法测定。P(NIPAM‐co‐DMA)的LCST约为39 °C，高于纯PNIPAM的LCST（32 °C）。引入亲水单体如DMA可提高NIPAM基共聚物的LCST[42]。通过调节NIPAM与DMA的摩尔比（14:1），P(NIPAM‐co‐DMA)的LCST升高至约39 °C。当温度升高超过P(NIPAM‐co‐DMA)的LCST时，由于聚合物链与水分子之间的氢键被破坏，材料会发生收缩。

形态与粒径研究

为了研究合成的交联共聚物和载药磁性纳米复合物的形态，采用了扫描电镜图像。图3显示了交联共聚物的形态。如图3所示，交联水凝胶共聚物和载药磁性纳米复合物均具有球形形貌。

交联共聚物水凝胶（纳米凝胶）和顺铂负载磁性纳米复合材料的平均直径分别约为90纳米和150纳米。与纳米凝胶相比，纳米复合物尺寸的增加可能与药物和磁性纳米颗粒掺入纳米凝胶基质有关。

图4显示了通过动态光散射测定的纳米凝胶和顺铂负载磁性纳米复合材料的粒径分布。未负载顺铂的P(NIPAM-co-DMA)纳米凝胶的粒径和Zeta电位分别约为167纳米和70毫伏。当顺铂和磁性纳米颗粒被加载到P(NIPAM-co-DMA)中后，粒径增大至189纳米，Zeta电位降低至0.7毫伏。纳米凝胶中DMA基团的存在赋予其正电荷。由于纳米凝胶和纳米复合物在溶液中的溶胀，以及动态光散射技术显示的平均流体动力学粒径大于扫描电镜结果。这是因为动态光散射测定了样品在溶液中的流体动力学直径，而扫描电镜测量的是干燥样品的直径。

磁化研究

采用振动样品磁强计（VSM）研究了载药纳米复合物的磁性。如图5所示，顺铂负载的P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄的饱和磁化强度为1.2 emu/g。该值低于磁性纳米颗粒（MNPs）测得的参考值为74 emu/g。图6展示了顺铂负载磁性纳米复合材料的分离和再分散行为。在无外磁场时，磁性纳米复合材料的分散液呈深色且均匀；当施加外磁场后，磁性纳米复合材料被吸引到试管侧壁，分散液变得透明。这些结果表明，Fe₃O₄纳米颗粒已成功包封在水凝胶基质中。当外磁场移除后，通过摇动可使磁性纳米复合物重新分散于水中。因此，具有磁响应性的磁性纳米复合物可用于靶向药物递送系统。

溶胀行为

表1显示了P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶在两种pH值和温度下的溶胀率。可以看出，溶胀率随温度和pH值的升高而降低。当温度升高至低临界溶解温度（LCST）以上时，PNIPAM中的碳氢相互作用占主导地位，导致聚合物与水之间的氢键减少，从而引起聚合物结构的坍塌。此外，随着pH值降低，DMA中的氨基发生质子化，带正电荷的铵侧基之间产生静电排斥，导致纳米凝胶的溶胀程度增加。

包封率和药物释放行为

将顺铂负载于P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶及其磁性纳米复合物[P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄]中，包封率分别为26.03%和40.3%。引入Fe₃O₄磁性纳米颗粒可能由于Fe₃O₄纳米颗粒上存在羟基官能团，从而提高了顺铂的包封率。图7(A,B)显示了载顺铂P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶和P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物在两种不同温度和pH值条件下持续10天（240小时）的释放曲线。两条曲线遵循相同的趋势。在40 °C（高于低临界溶解温度）时累积药物释放量更高，原因是纳米凝胶发生坍塌；而在37 °C时，纳米凝胶仍处于溶胀状态，顺铂通过扩散作用释放，因此释放速度较慢。此外，在pH 5.8条件下累积药物释放量高于pH 7.4。在酸性介质中，DMA的氨基被质子化，导致水凝胶进一步溶胀，从而增加药物释放。

纳米凝胶的释放行为。（B）顺铂负载的P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物的释放行为)

细胞毒性研究

细胞活力/毒性检测对于在真实样品中评估新型药物递送系统是必要的。使用MTT实验研究了P(NIPAM-co-DMA)纳米凝胶和载顺铂的P(NIPAM-co-DMA)/Fe₃O₄纳米复合物的生物相容性和细胞毒性。数据显示，不同浓度的P(NIPAM-co-DMA)纳米凝胶对细胞活力没有影响（图8(B)），因此可以认为适用于药物递送应用。在24小时时，游离顺铂在0.025–0.25 μM浓度下显示出较高的细胞毒性（图9(A)），但在48或72小时后，纳米复合物表现出显著更高的细胞毒性（p<.05），即使在低至0.0025 μM的剂量下也是如此（图9(B,C)）。顺铂和纳米复合物的半数抑制浓度分别为0.05和0.01（图9(D)）。

顺铂负载的P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物在HepG2肿瘤细胞中降低了细胞存活率并诱导了凋亡，这有助于减少患者化疗药物的剂量，从而降低高剂量依赖性副作用。该纳米复合物改善了顺铂向HepG2细胞的递送和积累。

纳米凝胶的细胞相容性，结果显示对HepG2细胞无明显细胞毒性)

/Fe₃O₄纳米复合物在24小时（A）、48小时（B）和72小时（C）后的不同浓度下的生长抑制率。孵育72小时后，半数抑制浓度降低至较低剂量（D）)

结论

基于纳米载体的癌症治疗的最终目标是开发出能够负载化疗药物的纳米载体和靶向部分，以实现智能、有效且安全的治疗。在本研究中，通过自由基乳液聚合合成了pH/温度响应型P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶。顺铂与磁性纳米颗粒（MNPs）在凝胶化后通过物理嵌入方式被载入纳米凝胶基质中。振动样品磁强计（VSM）结果表明，该纳米复合物具有超顺磁性。体外药物释放在pH 5.8、40 °C下高于pH 7.4、37 °C（生理条件）。P(NIPAM‐co‐DMA)纳米凝胶的体外细胞毒性试验显示其对HepG2细胞系无明显毒副作用，因此可被视为一种安全的药物载体。此外，载有顺铂的P(NIPAM‐co‐DMA)/Fe₃O₄纳米复合物由于其增强的递送和富集能力，在诱导HepG2细胞凋亡方面表现出显著提高的疗效。所开发的药物递送系统可实现抗肿瘤药物的智能释放、更高的载药量和药物释放，因而提供了一种有前景的递送系统，能有效抑制肿瘤生长并减少药物对其他健康组织的不良副作用。